Całkowita objętość do wyżarzania wynosiła 30 .l. Próbki gotowano przez pięć minut, a następnie pozostawiono do ochłodzenia do temperatury pokojowej na dwie godziny. Heteroduple zostały ponownie rozpuszczone w 12 .l wody. Odczynniki i objętości stosowane do modyfikacji chemicznej i reakcji cięcia były opisane przez Cotton i wsp., 29 z następującymi zmianami. Przeprowadzono reakcje tetratlenku osmu i hydroksyloaminy dla każdego heterodupleksu w 37 ° C przez 30 minut z 5 .l ponownie rozpuszczonej mieszaniny heterodupleksu. Po potraktowaniu piperydyną DNA wysuszono pod próżnią i ponownie zawieszono w 5 .l buforu ładującego (95% formamidu, 20 mmol EDTA na litr, 0,05% błękitu bromofenolowego i 0,05% ksylenowego cyjano-FF). Fragmenty analizowano za pomocą elektroforezy w 6% denaturującym żelu poliakryloamidowym, a następnie w auto-radiografii. Sekwencjonowanie nukleotydów w eksonie CFTR 11
Exon 11 amplifikowano z DNA pacjenta za pomocą PCR, jak opisano powyżej. Produkty PCR oczyszczono na 1% agarozie, 1,5% żelu NuSieve, trawiono BamHI i subklonowano w DNA M13mpl8. Jednoniciowy DNA wyizolowano i zsekwencjonowano za pomocą metody kończenia łańcucha dideoksy. 30, 31 Zsekwencjonowano cztery niezależne klony.
Badanie przesiewowe oligonukleotydów swoistych dla alleli
Łącznie 20 ul zamplifikowanego DNA zdenaturowano przez dodanie równej ilości 0,5 mola wodorotlenku sodu na litr i 1,5 mola chlorku sodu na litr przez 15 minut. DNA następnie przeniesiono na membranę nylonową. Po blottingu membranę zobojętniono przez 15 minut w 0,5 molach TRIS na litr i 1,5 mola chlorku sodu na litr. Oligonukleotydy (50 ng) reprezentujące normalne (5 GAGTGGAGGTCAACG3 ) i zmutowane (5 GAGTGGAAGTCAACG3 ) sekwencje znakowano kinazą w 20 .l reakcji zawierającej 70 mmol TRIS na litr, 10 mmol chlorku magnezu, 5 mmol ditiotreitolu na litr, 10 mCi [.32P] ATP i 10 U kinazy polinukleotydowej w 37 ° C przez 30 minut. Znakowane oligonukleotydy hybrydyzowano do blotu w buforze 40 mmol fosforanu sodu na litr (pH 7), mmol EDTA na litr i 7 procent dodecylosiarczanu sodu w 42 ° C przez 12 do 24 godzin. 32 Filtry płukano przez 15 minut w roztworze 40 mmol fosforanu sodu na litr, mmol EDTA na litr i 3 procent dodecylosiarczanu sodu, przez 30 minut w tym samym roztworze, z wyjątkiem tego, że zawierał procent dodecylosiarczanu sodu, i dla 15 minut w tym samym roztworze, z wyjątkiem tego, że zawierał 0,5 procentowy dodecylosiarczan sodu. Wszystkie płukania przeprowadzono w 42 ° C. Po przemyciu bloty eksponowano na folię z ekranami intensyfikującymi przez dwie do czterech godzin w temperaturze -70 ° C.
Wyniki
Tabela 1. Tabela 1. Wyniki badań fizjologicznych w badaniu propositus w porównaniu z danymi na temat normalnych osobników i pacjentów z mukowiscydozą * Wyniki badań fizjologicznych w propositus zestawiono w Tabeli 1. Jej nosowe właściwości bioelektryczne były charakterystyczne dla mukowiscydozy. : różnica potencjałów przeznabłonkowych była podwyższona, wystąpiło wyraźne zahamowanie różnicy potencjałów w wyniku nadmiaru amoniorydu 10-4 M, a różnica potencjałów dyfuzji chlorków, która jest wskaźnikiem przepuszczalności chlorków, była niska
[patrz też: wstrzas septyczny, supon katowice, kwas chlorogenowy cena ]
Comments are closed.
Jeśli nie chorujesz na jakaś popularną znaną przez lekarza chorobę
[..] Odniesienie w tekscie do ośrodek dla alkoholików[…]
Jak olej lniany to tylko świeży i przechowywany w lodówce w ciemnej butelce