Wszyscy pacjenci są teraz dobrze klinicznie, bez objawów limfoproliferacji, raka lub autoimmunizacji. Pozostałe rodzeństwo obu rodzin ma prawidłowy poziom immunoglobulin w surowicy i brak objawów niedoboru odporności. Jednak jedno z rodzeństwa pacjentów 2, 3 i 4 otrzymało diagnozę tocznia rumieniowatego układowego w wieku 13 lat, zgodnie z kryteriami Amerykańskiego Towarzystwa Reumatycznego. Metody
Przeprowadzono diagnostyczne badania krwi, biopsję szpiku kostnego, węzła chłonnego szyjnego i migdałków oraz szczepienie przeciwko wściekliźnie u pacjentów i członków rodziny po uzyskaniu ustnej zgody i zgodnie z wytycznymi lokalnych komisji ds. Etyki w Turcji, Kolumbii, i Holandii. Kontrole zapewniły pisemną zgodę.
Amplifikacja i analiza sekwencji genu CD19
Gen CD19 na chromosomie 16 (16p11.2) obejmuje 7,5 kb genomowego DNA i koduje białko o 556 aminokwasach, w tym DNA peptydu sygnałowego.18 wyizolowano z granulocytów, które wyizolowano przy użyciu wirowania w gradiencie Ficoll. Wszystkie 15 eksonów zostało zamplifikowanych przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) (sekwencje starterów są wymienione w części A Dodatkowego Dodatku, dostępne wraz z pełnym tekstem tego artykułu na stronie www.nejm.org) i zostały zsekwencjonowane w ABI Prism 377 sekwencer fluorescencyjny (Applied Biosystems).
Całkowicie komplementarny DNA (cDNA) został przygotowany z informacyjnego RNA (mRNA), który został wyizolowany z komórek jednojądrzastych pacjentów, jak opisano wcześniej.19 Fragmenty cDNA CD19 amplifikowano i sekwencjonowano w celu zweryfikowania mutacji znalezionych w genomowym DNA.
Transkrypty CD19
Poziomy transkryptu CD19 w limfocytach B krwi oznaczano ilościowo z mRNA o odwrotnej transkrypcji z komórek jednojądrzastych krwi pacjenta z zastosowaniem ilościowej PCR TaqMan w czasie rzeczywistym z nowo zaprojektowanymi starterami i sondą fluorescencyjną znakowaną FAM-TAMRA (sekwencje podano w Część B Dodatku Uzupełniającego). Poziomy transkryptu znormalizowano względem poziomów kontrolnego genu ABL i skorygowano względem liczby limfocytów B, jak określono za pomocą analizy cytometrii przepływowej.
Analiza hipermutacji somatycznej
Hipermutację genów immunoglobulin badano w fragmentach VH3-C., VH4-C., VH3-C. i VH4-C., które amplifikowano z cDNA i klonowano do łatwego wektora pGEM-T (Promega). Dwadzieścia jeden klonów Pacjenta 1, 44 klony Pacjenta 2, 39 klonów Pacjenta 3 i 39 klonów Pacjenta 4 zostały zsekwencjonowane. Zastosowano międzynarodowy system informacyjny ImMunoGeneTics (http://imgt.cines.fr/) w celu identyfikacji segmentów V, D i J oraz mutacji somatycznych.21 Stosunek mutacji zastępczych i cichych określono dla regionów szkieletowych i komplementarności – określanie regionów i rozkład mutacji zastępczych w regionach zrębowych analizowano zgodnie z dwumianowym modelem podziału Chang i Casali.
Cytometrii przepływowej
Wykonano immunofenotypowanie metodą cytometrii przepływowej próbek krwi od czterech pacjentów, dziewięciu krewnych (w tym ośmiu nosicieli) i ośmiu kontroli w celu oceny markerów i podgrup komórek B. Przeanalizowaliśmy również próbki szpiku kostnego od Pacjenta i od pięciu kontroli, jak opisano wcześniej.23 Przeciwciała przeciw CD21 (LB21), CD81 (JS-81) i CD225 (Leu13) zostały użyte do dalszej analizy kompleksu CD19.
Western Blotting
Komórki B we krwi zostały posortowane z komórek jednojądrzastych za pomocą zestawu do oczyszczania komórek B sortującego komórki powinowactwa magnetycznego (Miltenyi Biotec)
[przypisy: aparat ortodontyczny estetyczny cena, rtg zęba, najlepsze soczewki jednodniowe ]
[patrz też: radsas sport, wstrzas septyczny, neosine tabletki cena ]
Comments are closed.
[..] Cytowany fragment: stomatologia[…]
Prośbę o podanie nazwy ziół
[..] Oznaczono ponizsze tresci z artykulu oryginalnego: podgrzewacz do kamieni[…]
Widzę lekką poprawę